TỰ ĐỘNG PHÁT HIỆN VÀ PHÂN LẬP DNA CỦA TINH TRÙNG BẰNG CÁCH SỬ DỤNG NHUỘM SPERM HY-LITER TM VÀ HỆ THỐNG TÁCH MẪU ZEISS LASER MICRODISSECTION.

Giới thiệu

Mục tiêu cuối cùng của quá trình pháp y xử lý bằng chứng tấn công tình dục là xác định được kẻ tấn công thông qua cấu hình DNA (ở đây chúng tôi giả định một nạn nhân nữ và một kẻ tấn công nam, mô tả trường hợp phổ biến nhất). Điều này đòi hỏi DNA của kẻ tấn công phải được phân lập khỏi các nhân tố khác lẫn lộn.

Việc phát hiện và phân lập tinh trùng là một trong những quy trình tốn thời gian và kém hiệu quả nhất trong phân tích pháp y. Việc phát hiện tế bào tinh trùng từ bằng chứng tấn công tình dục hiện dựa trên việc xác định bằng kính hiển vi quang học của tế bào tinh trùng từ các chế phẩm nhuộm màu; các vết bẩn dựa trên mô học được sử dụng bởi các phòng thí nghiệm pháp y (thường là KPIC hoặc H&E). Cách nhuộm này tuy cho độ tương phản không thực sự rõ nét và độ đặc hiệu không cao, nhất là đối với các tinh trùng đã mất đi hình thái đặc trưng của chúng.

Ở đây, chúng tôi giới thiệu một quy trình làm việc kết hợp phương pháp nhuộm huỳnh quang miễn dịch để xác định đầu tinh trùng (SPERM HY-LITER ™ PI), sau đó tinh trùng được xác định và thu thập bằng hệ thống vi tách mẫu bằng laser ZEISS LCM (PALM MicroBeam) cho phép để phục hồi DNA chất lượng để tiến hành PCR từ ít nhất 25 tế bào tinh trùng.

Hệ thống vi tách mẫu PALM

Hệ thống bao gồm 01 kính hiển vi đảo ngược (có thể kết hợp huỳnh quang đa kênh theo yêu cầu), có bàn mẫu quét tự động, 01 nguồn laser (để cắt và tách mẫu), 01 bộ máy tính (bao gồm màn hình cảm ứng, theo yêu cầu) và phần mềm (để điều khiển quá trình tách mẫu và phân tích hình ảnh).

 Thu tách mẫu không chạm, ngược trọng lực nên tránh nhiễm bẩn mẫu (công nghệ độc quyền của Carl Zeiss). Sử dụng tia laser UV cận vùng khả kiến (bước sóng λ=355 nm). Cho phép tách mẫu ở mức mô, tế bào riêng rẽ, bào quan, NST. Cho phép phân lập tế bào sống mà không ảnh hưởng đến đặc tính sinh lý, hóa sinh của tế bào. Khả năng phân tách mẫu tự động, chính xác, không nhiễm tạp – các phương pháp truyền thống không thể thực hiện được

Chuẩn bị mẫu

Gạc hoặc vải được đặt trong giỏ quay để thu dịch chiết, sau đó được ly tâm ở ~ 13.000 x g trong 5 phút. Sau khi loại bỏ phần nổi phía trên, tế bào được ngâm lại trong 20 - 40 µl PBS và được thêm vào phiến kính LCM và để khô trong không khí.

Nhuộm SPERM HY-HILITER ™ PI theo chỉ dẫn của nhà sản xuất

Phân tích hình ảnh tự động

Tế bào tinh trùng (màu xanh lá cây) và tế bào sinh dục (màu đỏ)

Tinh dịch nhuộm SPERM HY-HILITER ™ PI thu được hình ảnh ở 3 kênh (trường sáng, Alexa 488 & PI); Nhuộm PI ở nhân xác định tất cả các nhân tế bào (nghĩa là cả tinh trùng và tế bào biểu mô đều được đánh dấu bằng thuốc nhuộm này) trong khi tế bào tinh trùng được đánh dấu đặc biệt bằng Alexa 488 (kháng thể đặc hiệu đầu tinh trùng trong SPERM HY-LITER ™ đã được tạo dẫn xuất với Alexa 488). Do đó có thể phân biệt được sự khác biệt giữa các tế bào biểu mô, nhân được giải phóng và tinh trùng bằng cách phân tích hình ảnh huỳnh quang.

Phần mềm nhận dạng gắn nhãn các tế bào tinh trùng có màu xanh lục và tế bào biểu mô có màu đỏ trên hình ảnh đã xử lý.

Vi tách mẫu tự động bằng PALM Microbeam.

Nguyên lý: tia laser cô lập mẫu mong muốn và chuyển mẫu vào nắp thu. Tự động lập hồ sơ về các tế bào tinh trùng trước LCM và sau LCM, cho biết đã chuyển thành công vào nắp thu thập.

Các phần tử đã được xác định (tinh trùng hoặc tế bào biểu mô) sau đó được tự động phân tách riêng lẻ và được phóng tới các nắp kết dính riêng biệt.  Quá trình bóc tách hoàn toàn tự động không tiếp xúc và không nhiễm bẩn. 

Các tế bào thu được sau đó được xử lý bằng bộ OneTouch LCM. Các ống nắp kín được ủ với ProK và DTT ở nhiệt độ cao và DNA được tinh sạch qua các cột spin trừ Xs theo giao thức của nhà sản xuất. DNA tinh khiết có thể được sử dụng trực tiếp hoặc cô đặc bằng cách ly tâm chân không trước khi được thêm vào bộ kit multiplex STR-PCR. Phản ứng PCR được phân tích bằng phương pháp điện di mao quản. Nếu được yêu cầu, nồng độ sau PCR và tinh chế amplicon có thể được sử dụng để tăng thêm tín hiệu điện di mao quản.

Thảo luận

Người ta ước tính rằng có đến một nửa nỗ lực dành cho các phòng thí nghiệm DNA pháp y được dành cho việc xử lý và phân tích bằng chứng tấn công tình dục. Tỷ lệ thành công của hồ sơ DNA từ loại bằng chứng này khá thấp, phần lớn là do phương pháp tách chiết khác biệt không hiệu quả.

Sự kết hợp giữa phát hiện miễn dịch huỳnh quang với phân tích hình ảnh hiện đại và vi tách laser mang lại sự gia tăng chưa từng có về độ đặc hiệu, độ nhạy và hiệu quả. Bằng cách thực hiện quy trình này, các phòng thí nghiệm DNA pháp y được đảm bảo nâng cao tỷ lệ thành công trong hồ sơ DNA của họ từ bằng chứng tấn công tình dục.