Sử dụng adapter camera phù hợp để tăng tín hiệu ảnh huỳnh quang cho ảnh hiển vi

Đối với các thí nghiệm sử dụng kính hiển vi huỳnh quang, tỉ lệ nhiễu ảnh hưởng không hề nhỏ đến chất lượng hình ảnh và kết quả thí nghiệm. Có một số phương pháp nổi tiếng để tăng tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu (SNR), chẳng hạn như kéo dài thời gian phơi sáng của máy ảnh hoặc tăng cường độ ánh sáng.

Hình 1: Một loạt các thời gian phơi sáng tăng dần được ghi lại bởi máy ảnh CMOS (ZEISS Axiocam 702 mono). Thời gian phơi sáng từ trái sang phải: 0,375 ms, 1,5 ms, 10 ms và 80 ms. Thời gian phơi sáng lâu hơn mang lại chất lượng hình ảnh tốt hơn đáng kể, nhưng chúng mất nhiều thời gian hơn để ghi lại và để mẫu vật tiếp xúc với liều lượng ánh sáng chiếu sáng cao hơn.

Tuy nhiên, những phương pháp này cũng dẫn đến kéo dài thời gian và làm tăng độ hư hỏng của mẫu vật, tẩy trắng và gây độc tính quang.

Khi nhiễu hình ảnh đã được giảm xuống mức thấp nhất có thể đạt được trong thực tế, SNR (tỉ lệ tín hiệu/ nhiễu) chỉ có thể được cải thiện hơn nữa bằng cách tăng tín hiệu có thể sử dụng, tức là thu thập nhiều ánh sáng hơn trên mỗi pixel của hình ảnh. Điều này đòi hỏi các máy ảnh phải chuyển đổi hơn 70% các photon được hấp thụ thành tín hiệu điện và do đó thành hình ảnh.

Binning (tích hợp pixel)

Lượng ánh sáng trên mỗi pixel cũng có thể được tăng lên bằng cách phóng to các pixel hình ảnh. Các pixel hình ảnh lớn thu thập ánh sáng mà nếu không sẽ được chia thành nhiều pixel nhỏ, do đó tăng tín hiệu trên mỗi pixel và do đó cải thiện SNR của hình ảnh.

Pixel binning là một phương pháp kết hợp các pixel cảm biến liền kề, chẳng hạn như 2 × 2 trở lên, thành các pixel hình ảnh lớn hơn. Các pixel kết hợp thu thập nhiều tín hiệu hơn các pixel nhỏ riêng lẻ và do đó cung cấp SNR tốt hơn. Vì pixel binning làm giảm tổng số pixel trong một hình ảnh, nó cũng làm giảm kích thước dữ liệu, cải thiện luồng dữ liệu, giảm yêu cầu lưu trữ và tăng tốc độ hình ảnh tối đa.

Thật không may, các pixel hình ảnh lớn hơn kém hiệu quả hơn trong việc chụp các chi tiết nhỏ của mẫu vật, đặc biệt nếu các pixel hiệu quả lớn hơn độ phân giải của kính hiển vi. Đây thường là vấn đề với các vật kính có độ phóng đại trung bình / NA cao (ví dụ: 20 × / 0,8, 40 × / 1,3 hoặc tương tự), trong khi các vật kính có độ phóng đại cao (63 × và 100 ×) thường có thể chịu được sự phân chia vừa phải mà không mất độ phân giải.

Sử dụng adapter phù hợp

Pixel binning không phải là cách duy nhất để tăng kích thước pixel hiệu quả. Điểm ảnh cũng có thể được tăng lên bằng cách giảm độ phóng đại của kính hiển vi, chẳng hạn bằng cách sử dụng một vật kính có độ phóng đại thấp. Tuy nhiên, ống kính có độ phóng đại thấp thường có khẩu độ số thấp hơn (NA) và do đó kém hiệu quả hơn trong việc thu thập ánh sáng, điều này lại tác động tiêu cực đến SNR. Để cải thiện SNR, người ta sẽ cần giảm độ phóng đại của kính hiển vi trong khi vẫn giữ NA cao! Điều này có thể được thực hiện bằng cách sử dụng adapter camera. Adapter (hay bộ chuyển đổi máy ảnh) là một bộ phận kết nối máy ảnh của kính hiển vi với thân của kính hiển vi.

Phiên bản đơn giản nhất của adapter chỉ là một ống kim loại rỗng, có ren. Adapter như vậy không làm thay đổi độ phóng đại của hệ thống kính hiển vi. Do đó, hệ số phóng đại của adapter này là 1x.

Ngược lại, adapter 0,5 × bao gồm một hệ thống thấu kính làm giảm độ phóng đại hiệu quả của hệ thống kính hiển vi xuống hai lần. Điều này sẽ làm giảm kích thước của hình ảnh trên cảm biến máy ảnh. Do đó, kích thước hiệu dụng của các pixel hình ảnh tăng gấp hai lần và diện tích của mỗi pixel hình ảnh tăng gấp bốn lần. Mỗi điểm ảnh hiện thu thập trung bình nhiều hơn 4 lần ánh sáng, dẫn đến SNR tăng đáng kể. Tác dụng của adapter 0,5 × tương tự như ghép nối cảm biến 2 × 2.

Hình 2: Sơ đồ hình thành hình ảnh với adapter 1,0 × (trái) và 0,5 × (phải). Thấu kính làm giảm độ phóng đại trong adapter máy ảnh 0,5 × làm giảm kích thước của hình ảnh trên cảm biến hình ảnh và do đó tăng thông lượng ánh sáng được thu thập bởi các điểm ảnh.

Adapter máy ảnh cung cấp khả năng ghép ảnh hoàn toàn bằng phương tiện quang học, nên nó có một số lợi ích so với tính năng ghép điểm ảnh cảm biến. Quan trọng nhất, tính năng ghép ảnh quang học không làm giảm số lượng pixel hình ảnh và người dùng vẫn có thể tận hưởng lợi thế của số lượng pixel đầy đủ do máy ảnh của mình cung cấp. Vì các pixel hình ảnh hiện nay lớn hơn một cách hiệu quả, bộ điều hợp cũng cho phép kính hiển vi hình ảnh một vùng lớn hơn của mẫu chỉ với một lần chụp. Ví dụ, bộ điều hợp máy ảnh 0,5 × cho phép ghi với một hình ảnh duy nhất một khu vực tương đương với bốn hình ảnh được ghi bằng bộ chuyển đổi 1,0x.

Hình 3: Hình ảnh về ty thể thu được trong điều kiện chụp ảnh giống hệt nhau và hai adapter máy ảnh khác nhau. ZEISS Axiocam 512 mono bên trái với bộ chuyển đổi 1,0 ×, kích thước hình ảnh 1,3 mm × 0,9 mm, bên phải ZEISS Axiocam 512 mono với bộ chuyển đổi máy ảnh 0,5 ×, kích thước hình ảnh 2,6 mm × 1,8 mm cho độ phân giải tốt hơn để nhìn rõ hơn các cho tiết.

Kết luận

Adapter máy ảnh kính hiển vi là một công cụ giá cả phải chăng và dễ sử dụng để điều chỉnh thiết lập kính hiển vi và tối ưu hóa độ phân giải, độ nhạy và trường nhìn cho các ứng dụng hình ảnh khác nhau.

Hình 4: các loại adapter máy ảnh ZEISS với độ phóng đại 1,0 ×, 0,63 × và 0,5 ×